İnfertilite, üreme çağındaki çiftlerin %15’ini etkilemektedir. Etkili faktörler olarak %30-40’ında erkeğe, %40-50’sinde ise kadına bağlı nedenler belirtilmektedir. Bu tür problemler nedeni ile pek çok çift tüp bebek tedavisine müracaat etmektedir. Bu maksatla tedaviye başlamadan önce erkek ve kadında kısırlık veya nedenlerini ortaya koymak için bir dizi test yapılmaktadır.
Erkeğe bağlı nedenleri araştırmak için yapılan testlerden ilki, spermiogram olarak da adlandırılan sperm testidir. Bu testte sperm sperm sayısı, şekli ve kadın genital kanallarında düzgün ilerleme yeteneği açısından spermin hareketliliği araştırılır.
Bunun haricinde, özel bir boya ile boyanarak spermlerin morfolojik özellikleri Kruger yöntemi ile değerlendirilir. Amaç, sperm fertilite kapasitesi hakkında fikir edinmektir.
Bazen, yapılan birçok testin normal olmasına karşın fertilite başarısızlıkları ve hatta döllenme olsa bile düşükler oluşmaktadır. Bu tür açıklanamayan problemlerde ilk yapılanlardan biri, erkek partnerin değerlendirilmesidir. Çünkü sperm DNA hasarı erkek infertilitesinin en önemli etkenlerinden biridir. Açıklanamayan infertilite tanısı almış bu çiftlerde, erkekten alınan örneklerde sperm DNA hasar oranı sıklıkla yüksek olarak gözlenmektedir. Oysa gebelik oluşumu ve devamlılığı için büyük önem taşıyan sperm kalitesinin, DNA hasarına bağlı olup olmadığı yukarıda sözü edilen testlerle ortaya konamaz.
Kabul Edilen Sperm DNA Hasar Oranları
DNA hasar oranının fertilite açısından sınırını ortaya koyacak net bir cevap yoktur. Ancak şu gerçek ki, sperm DNA hasar oranı yükseldikçe fertilizasyon başarısı düşmekte ve fertilizasyon olsa bile bunlardan gelişebilecek embriyoların gelişimi de bozulabilmektedir. Yine hasarın önemli/önemsiz gibi ayrımını ortaya koyabilecek ne yazık ki bir test de bulunmamaktadır. Genel itibarı ile;
- <%15 : Düşük (iyi durumda) DNA hasarı
- %15-25 : Sınırda (kabul edilebilir) DNA hasarı
- %25-50 : Yüksek DNA hasarı
- >50 : Çok yüksek DNA hasarı olarak değerlendirilebilir.
Sperm DNA Hasar İstem Nedenleri
- Açıklanamayan infertilite,
- Müdahalelere rağmen tekrarlayan fertilizasyon başarısızlığı,
- Embriyoların gelişiminde problem gözlenmesi,
- Tekrarlayan düşük gibi durumlarda DNA hasar testi istenir.
Sperm DNA Hasarlarının (Fragmantasyonu) Saptanması
Sperm DNA bütünlüğünü değerlendirmek için çalışmalarda birçok yöntem kullanılmaktadır. Sıklıkla kullanılanları:
1. TdT-dUTP nick-end-labelling (TUNEL) yöntemi,
- Floresan Mikroskop
- Flow sitometri
2. Tek hücre jel elektroforezi (COMET Analizi),
3. Sperm Kromatin Ayrılma Testi (Halosperm Test),
4. Floresan in situhibridizasyon (FISH)
Terminal Uridine Nick-End Labeling (TUNEL) Yöntemi
Denge Laboratuvarı olarak da yapmakta olduğumuz TUNEL yöntemi kabul görmüş ve klinisyenler tarafında daha sıklıkla talep edilen yöntemdir. Bu yöntemde, terminal deoksinükleotidiltransferaz (TdT) DNA polimeraz enziminden yararlanılır. Bu enzim DNA’daki tek ya da çift zincirde oluşan hasarlı DNA’nın 3’hidroksil ucuna rastgele deoksiribonükleotidler (dUTP) ekler. Ortama eklenen floresan bu dUTP’lere bağlanır. Bağlanan floresan yoğunluğu floresan mikroskop ile veya flowsitometri ile ölçülerek hasarlı hücre miktarı tayin edilir (Şekil-1).
Tek Hücre Elektroforezi (COMET analizi) Yöntemi
Erkek infertilitesini belirlemede kullanılan hassas bir yöntemdir. Bu yöntem nötral ya da alkali ortamda yapılabilir. Nötral tamponda sadece çift zincir kırıkları tespit edilebilirken, alkali tamponlarda hem çift zincir hem de tek zincir kırıkları tespit edilebilmektedir. Alkali pH da farklı molekül ağırlıklarına ve farklı elektrik yüke sahip DNA moleküllerinin elektriksel alanda farklı şekilde göç etmeleri esasına dayanır. Hasarsız DNA’ların bütünlüğünü kaybolmadan yürür ve comet (kuyruk) oluşturmaz. Oysa, hasarlı DNA’ların fragmenleri oluşan hasardan dolayı farklı moleküler ağırlıklara ve farklı elektrik yüklerine sahip olduklarından elektriksel alanda farklı hızda hareket eder ve kuyruk şeklinde bir görüntü oluştururlar. Sonuç olarak elde edilen DNA göç görüntüleri değerlendirilerek bir fikir oluşturulur.
Sperm Kromatin Ayrılma Testi (Halosperm Test)
Spermler agaroz matriks jele yerleştirilir ve denature olması için asit solüsyon eklenir. Ortamdan sperm membranı ve proteinlerinin uzaklaştırılır. Normal DNA’ya sahip spermler geniş halolar oluşturacak şekilde DNA’larını salarlar. Çok küçük halo veren ya da hiç halo oluşturmayan spermler fragmante DNA içeren spermlerdir.
Floresan İn Situ Hibridizasyon (FISH) Yöntemi
Agaroz matrikse gömülmüş veya lam üzerine fikse edilmiş spermler denatürasyon alkali solüsyona maruz bırakılır. DNA çift sarmal yapı açılır ve tek sarmal DNA oranı artar. DNA fragmantasyonunun artması tek sarmal DNA miktarını arttırır. DNA’ya floresan işaretli problarla in situ hibridizasyon yapılarak DNA hasar oranı saptanır.
Kaynaklar:
Lewis SEM. The place of sperm DNA fragmentation testing in current day fertility management. Middle East Fertility Society J. 18(2) 2013, 78-82
Bayram H, Cıncık M. Açıklanamayan İnfertil Çiftlerde Erkek Faktörü: Sperm DNA Fragmantasyonu Değerlendirmesi. Tıp Fakültesi Klinikleri. 3(3), 2020. 109-113
Fidan AF. DNA hasar tespitinde tek hücre jel elektroforezi. AKÜ-Fen Bilimleri Dergisi 8(1)
https://www.google.com.tr/search?q=sperm+dna+fragmentation+tunel+assay&tbm=isch&ved=2ahUKEwi93ZvVtP7zAhXBPOwKHT-PBHMQ2-cCegQIABAA&oq=sperm+dna+fragmentation+tunel+assay&gs_lcp=CgNpbWcQAzoECAAQE1DbCVjVF2CYGWgAcAB4AIABxgGIAZYHkgEDMC43mAEAoAEBqgELZ3dzLXdpei1pbWfAAQE&sclient=img&ei=IKqDYb1NwfmwB7-ekpgH&bih=657&biw=1366&hl=tr#imgrc=IubDhlRaM3-HRM (Erişim: 04.11.2021)
Rahiminia T, Yazd EF et al. Sperm chromatin and DNA integrity, methyltransferase mRNA levels, and global DNA methylation in oligoasthenoteratozoospermia. Clin Exper Repr Med 45(1): 2018, 17.